Ojo: necesitaremos llevar a la práctica 10 gramos de hígado
Obtendremos un extracto de proteínas a partir de muestras biológicas mediante métodos de lisis y precipitación en frío
Aparatos, equipos e instrumentos
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Cantidad
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Requisitos técnicos
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Microcentrífuga refrigerada | 1 | Para tubos eppendorf 1,5ml |
Centrífuga refrigerada | 1 | Para tubos falcon de 15ml |
Micropipetas (1000 ul) | 5 | calibradas |
Balanza analítica | 1 | calibrada |
Refrigeradora | 1 |
Materiales
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Cantidad
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Especificaciones
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Mortero
con vástago
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5
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Pipetas
Pasteur de 1,5mL
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10
unidades
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Guantes
de látex
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20
pares
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Talla
S, M y L
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Guardianes
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3
unidades
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Puntas
de micropipetas de 1000uL
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3
rack
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Tubos
eppendorf de 1,5ml
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12
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Tubos
falcón de 15ml
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12
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Cajas
con hielo
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5
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5x5cm
aproximadamente
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Reactivos
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Cantidad
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Especificaciones
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PBS
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20
ml
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Frío:
NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4
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Sulfato
de amonio saturado
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5
ml
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Frío
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Agua
destilada
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10
ml
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Fría
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Extracción de proteínas
1. Pesar 10g de muestra biológica (hígado o carne).
2. Colocar un trozo de tejido en el mortero sobre el hielo. Agregar 1500 μl PBS.
Homogeneizar con el vástago hasta disgregar el tejido.
De ser necesario agregar más PBS para seguir disgregando (anotar el volumen extra agregado)
Tomar el extracto líquido con micropipeta (utilizando p1000) evitando aspirar los trozos menos disgregados de tejido.
3. Centrifugar 15 minutos a 14.000 rpm a 4°C
4. Colocar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y conservar en hielo.
*PBS (buffer fosfato salino): NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH of 7,4
Precipitación con Sulfato de amonio
5. Realizar las diluciones de la solución saturada de SO4(NH4)2 indicadas a continuación:
- % Solución saturada de Sulfato de amonio07030100Volumen de agua (ul)500150350-Volumen de Sulfato de amonio saturado (ul)-350150500
Agregar 100 μl de las diluciones de SO4(NH4)2 en le tubo correspondiente.
7. Agitar vigorosamente durante unos segundos
8. Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm.
9. Tomar los sobrenadantes obtenidos y pasar a un nuevo tubo con el mismo rótulo, y descartar el tubo con el pellet.
10. Conservar en hielo si se va a cuantificar y sino a -20°C.
PREGUNTAS DE REPASO:
1. ¿Por qué utilizamos sulfato amónico y no sal de cocina (NaCl)?
2. ¿Por qué el sulfato amónico ayuda a que las proteínas precipiten?
3. ¿Por qué se realiza todo el proceso de extracción de proteínas a 4°C?
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