Realizar el montaje experimental de la reacción en cadena de la Polimerasa (PCR). Conocer el fundamento teórico y las aplicaciones de la reacción de PCR.
Alcance
Esta práctica de laboratorio comprende el ensamblaje de la reacción de PCR y el corrimiento de la misma en un termociclador, el DNA resultante, amplicones, se almacenará para su visualización en gel de electroforesis en la siguiente práctica.
Requisitos previos a la realización de la práctica
Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el fundamento teórico de la reacción en cadena de la Polimerasa y la guía de práctica. Al inicio de la práctica se realizarán preguntas acerca de las lecturas.
Aparatos, equipos e instrumentos
Aparatos, equipos e instrumentos
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Cantidad
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Requisitos técnicos
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Plancha de calentamiento con agitación magnética
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1
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Juegos de micropipetas (10, 200, 1000 ul)
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3
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calibradas
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Microcentrífuga
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1
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calibrada
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Balanza analítica
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1
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calibrada
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Microondas
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1
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Cámara de electroforesis (agarosa)
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1
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Con todos los accesorios
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Fuente de poder
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1
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Documentador de geles
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1
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Parámetros, magnitudes y rangos a ser determinados
Determinar las temperaturas de: denaturación, hibridación o annealing y extensión, para calibrar la curva en el termociclador adecuada para obtener la amplificación del DNA diana.
Materiales y reactivos
Materiales
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Cantidad
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Especificaciones
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Tubos
eppendorf
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20 unidades c/u
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0,2-0,5-1 ml
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Gradillas
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3 unidades
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Para tubos eppendorf
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Guantes de látex
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30 pares
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Talla M y L
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Guardianes
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3 unidades
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Puntas de micropipeta
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1 rack c/u
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0,2-0,5-1 ml
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Toallas de papel
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30
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Reactivos
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Cantidad
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Especificaciones
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Agua MiliQ
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100 ml
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estéril
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dNTPs
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20 ul
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99%
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Taq polimerasa
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2 ul
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5u/ul
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Buffer o tampón de reacción
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30 ul
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10X
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Primer
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6 ul c/u
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10 uM c/u
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ADN diana
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6 ul
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MgCl2
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10 ul
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50mM
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Conceptos básicos sobre replicación del ADN y transmisión de información genética. Introducción al manejo del equipamiento básico del laboratorio de Biología Molecular
Descripción del procedimiento
Preparación de la muestra para PCR
· Sobre una cubeta con hielo picado colocar un tubo eppendorf estéril para preparar la master mix o mezcla maestra para PCR, usando la hoja especialmente diseñada para el objeto.
· Todos los reactivos deben ser sacados del congelador poco tiempo antes de hacer la mezcla y deberán ser mantenidos sobre hielo picado antes y después de ser usados. Al descongelarlos se debe cuidar de que todo el reactivo se disuelva completamente.
· Para la adición de cada reactivo se deben utilizar puntas de pipeta nuevas y estériles. La preparación de la mezcla se debe realizar con mascarilla y guantes.
· Evitar tocar el extremo de las puntas a usarse con cualquier material, el pelo, la piel, etc.
· La cantidad de master mix a preparar debe ser calculada según el número de tubos de reacción.
Master
mix (volumen final por tubo de reacción = 50 ul)
Ingrediente/tubo Cantidad/tubo
Taq 0,2
ul
MgCl2 50mM 1 ul
dNTPs 10mM 2 ul
Primers 10µM 2 ul c/ primer
Tampón
de reacción 10X 5 ul
Agua
bidestilada o ultrapura 35,8
ul
· Colocar 48 ul de master mix en cada tubo de reacción (tubos eppendorf 0,2 ul). Añadir a cada uno 2 ul del ADN extraído.
· Agregar de 2 a 3 gotas de aceite mineral a cada tubo de reacción dejándolo correr por las paredes. Cerrar bien los tubos y llevarlos al termociclador, que debe haber sido programado con anterioridad.
· Una vez terminados los ciclos respectivos, congelar los tubos de reacción en caso de no usarlos inmediatamente.
Cálculo de la temperatura de anillamiento
La temperatura de anillamiento de cada primer se calcula sumando el número de bases del primer utilizando esta fórmula
Ta = (A + T) x 2 + (G + C) x 4 el resultado se expresan en grados centígrados
Como tenemos dos primers debemos calcular la temperatura media sumando Ta del primer primer al del segundo y dividiendo por dos. Si existe mucha diferencia de temperaturas (por ejemplo más de 10° C de diferencia) en ese caso se coge la Ta menor ¿Qué razón existe para esto?
Datos a ser registrados y el método de análisis y de presentación de resultados
Se deberá elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la rúbrica detallada. Los primers que utilizaremos para amplificar el ADN de sangre periférica que habéis extraído son:
Primer PTPN22 C1858T Fw 5´-ACTGATAATGTTGCTTCAACGG-3´
Primer PTPN22 C1858T Rv 5´-TCACCAGCTTCCTCAACCAC-3´
Primer PTPN22 C1858T Rv 5´-TCACCAGCTTCCTCAACCAC-3´
Si en vez de amplificar ADN de sangre perifèrica utilizamos bacterias podemos amplificar parcialmente el 16S rRNA de E. coli. Para ello tomo una colonia de E. coli y la disuelvo en 1ml de agua destilada y lo hiervo durante 10-15 min. Tomo 0.5-1 ul de este tubo para amplificar por PCR.
Primer 1: 5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′
Prime 2: 5′-ATTACCGCGGCTGCT-3′
Para amplificar 16S rRNA están en el laboratorio estos primers:
16S Amplicon PCR 341 Forward Primer = 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
16S Amplicon PCR 805 Reverse Primer = 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC
De la región: 16S V3 y V4
600 pb es el tamaño esperado
Para visualizar por cromatografía de agarosa este experimento con los primers 6S Amplicon PCR 341 F y 16S Amplicon PCR 805 R haz clic aquí
EJERCICIOS:
a) ¿Por qué cuando preparamos el master mix y añadimos la Taq polimerasa no mezclamos utilizando el vortex?
b) ¿De qué depende la temperatura de annealing o unión de los primers? Explique.
c) ¿Qué ocurre cuando utilizamos una temperatura de anillamiento 20 ° C menor de la temperatura de anillamiento recomendada?
c) ¿Por qué es recomendable usar material nuevo y estéril para PCR?
d) Si hacemos una amplificación de ADN mediante PCR ¿Cuál será el control negativo y cuál el positivo?
e) Como tenemos dos primers debemos calcular la temperatura media sumando Ta del primer primer al del segundo y dividiendo por dos. Si existe mucha diferencia de temperaturas (por ejemplo más de 10° C de diferencia) en ese caso se coge la Ta menor ¿Qué razón existe para esto?
f) Tengo que preparar un master mix siguiendo la siguiente receta:
a) ¿Por qué cuando preparamos el master mix y añadimos la Taq polimerasa no mezclamos utilizando el vortex?
b) ¿De qué depende la temperatura de annealing o unión de los primers? Explique.
c) ¿Qué ocurre cuando utilizamos una temperatura de anillamiento 20 ° C menor de la temperatura de anillamiento recomendada?
c) ¿Por qué es recomendable usar material nuevo y estéril para PCR?
d) Si hacemos una amplificación de ADN mediante PCR ¿Cuál será el control negativo y cuál el positivo?
e) Como tenemos dos primers debemos calcular la temperatura media sumando Ta del primer primer al del segundo y dividiendo por dos. Si existe mucha diferencia de temperaturas (por ejemplo más de 10° C de diferencia) en ese caso se coge la Ta menor ¿Qué razón existe para esto?
f) Tengo que preparar un master mix siguiendo la siguiente receta:
Master mix (volumen final por tubo de reacción = 50 ul)
Ingrediente/tubo Cantidad/tubo
Taq 0,2 ul
MgCl2 50mM 1 ul
dNTPs 10mM 2 ul
Primers 10µM 2 ul c/ primer
Tampón de reacción 10X 5 ul
Agua bidestilada o ultrapura 35,8 ul
Sin embargo, es imposible coger un volumen de 0.2 ul porque las pipetas grises, las que se emplean para volúmenes pequeños sólo pueden trabajar entre 0.5 ul y 10 ul, siendo el menor volumen que pueden tomar con cierta precisión 0.5 ul. ¿Cómo resuelves este problema?
Para saber más
Sin embargo, es imposible coger un volumen de 0.2 ul porque las pipetas grises, las que se emplean para volúmenes pequeños sólo pueden trabajar entre 0.5 ul y 10 ul, siendo el menor volumen que pueden tomar con cierta precisión 0.5 ul. ¿Cómo resuelves este problema?
Para saber más
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cuando las muestras están diluidas en el eluyente (Tris-HCl pH 7.5) lo cual indica que el DNA está razonablemente limpio de proteínas que pudiesen intervenir con aplicaciones siguientes. La ausencia de RNA contaminante se podría confirmar al realizar una electroforesis en gel de agarosa