Electroforesis en gel de agarosa

Electroforesis de ADN: Conceptos Básicos

Aparatos, equipos e instrumentos

Aparatos, equipos e instrumentos	Cantidad	Requisitos técnicos
Plancha de calentamiento con agitación magnética	1
Juegos de micropipetas (10, 200, 1000 ul)	3	calibradas
Microcentrífuga	1	calibrada
Balanza analítica	1	calibrada
Microondas	1
Cámara de electroforesis (agarosa)	1	Con todos los accesorios
Fuente de poder	1
Documentador de geles	1

Materiales y reactivos

Materiales	Cantidad	Especificaciones
Tubos eppendorf	10 unidades c/u	0,5-1,5 ml
Gradillas	3 unidades	Para tubos eppendorf 1,5ml
Cámara de electroforesis	3 unidades	Con todos los accesorios
Guantes de látex	20 pares	Talla M y L
Vasos de precipitación 100ml	3 unidades
Puntas de micropipetas	1 rack c/u	0,2-0,5-1 ml
Reactivos	Cantidad	Especificaciones
SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain	10 ul	frio
Agarosa	2 gramos	polvo
Buffer de Carga para Ácidos Nucleicos	50 ul	Frio
Buffer TBE 1X	1 L

Descripción del procedimiento

•  Pesar agarosa para tener una concentración de 1% (1 gr en 100 ml). Tened en cuenta que dependiendo del tipo de cubeta podemos tener distintos volúmenes. La agarosa tiene que disolverse en TBE 1X

•  Calentar la solución hasta que se disuelva la agarosa cuidando de que al hervir no se riegue la misma.

•  Dejar enfriar la solución hasta aproximadamente 55 0C y agregar 8 microlitros de SYBR Gold (10.000X) al gel y mezclar bien.  Preparar el molde del gel y verter la solución en el mismo moviendo las burbujas hacia la orilla.

•  Colocar la peinilla en el gel y dejar que éste se solidifique, entonces retirar la peinilla con cuidado.

•  En un pedazo de parafilm limpio colocar 5 microlitros de buffer de carga por cada tubo de reacción y mezclar con 7 microlitros de muestra a correr.

•  Colocar el gel en la cámara de electroforesis y cubrirlo con TBE 1X.  Colocar la mezcla obtenida en el paso 5, en cada uno de los pocillos del gel preparado anteriormente.

•  Proceder a la electroforesis a voltaje constante (90 voltios).

Buffer de carga. Cf = 10 mM, Vf = 10ml

Formamida                                             9.4 ml

Colorante (50 mg en 1 ml dH20)            100 ul

0.5 M EDTA                                            200 ul

Enrasar a 10 ml con dH20                        

La formamida desnaturaliza el ADN y el EDTA es un agente quelante.

TBE 1X

108 g Tris base

55 g ácido bórico

900 ml dH2O

40 ml 0.5 M EDTA  (pH 8.0)

Ajustar el volumen a  1 L. 

Se filtra con un filtro de 0.2 um para eliminar las partículas que fomentarían la precipitación

Recursos adicionales

Conocimiento de fundamentos de electroforesis y del cálculo de porcentaje de gel de agarosa en función de la longitud de las moléculas de ácido nucleico a separar.

Conocimiento de manejo del equipamiento necesario para la producción y montaje de un gel de agarosa.

Descripción de los canales de izquierda a derecha: 1 Marcador de peso molecular 100 bp Invitrogen 2 control positivo de alrededor de 650 pb lo cual es correcto 3 control negativo, no se ha amplificado nada, correcto 4 DNA amplificado por PCR del tamaño correcto +/- 650 pb. Los canales 5,6, 8 y 9 corresponden a DNA amplificado correctamente por PCR. La PCR del canal 7 no ha amplificado el DNA. Las bandas difusas que se observan en la parte baja del gel corresponden a los primers de ADN que nos se incorporaron al ADN amplificado.

Alumnos cargando los geles

El colorante migra hacia el polo positivo (rojo)

Fotografía de una cromatografía de agarosa 1% corrida a 100V. El fragmento amplificado de 600 pb tiene el tamaño esperado al amplificarlo por PCR sobre ADN de bacteria amplificado con  los primers 6S Amplicon PCR 341 F y 16S Amplicon PCR 805 R

Para saber más sobre electroforesis

Un poco de historia sobre el agar agar

Para saber más sobre agarosas  

PREGUNTA 1. ¿En base a qué la electroforesis de agarosa separa moléculas? La electroforesis separa las moléculas en base a su tamaño, carga y forma.

PREGUNTA 2. Explicar la migración de acuerdo con la carga. Las moléculas que tienen una carga negativa migraran hacia el polo positivo; mientras que las moléculas cargadas positivamente migrarán hacia el polo negativo.

PREGUNTA 3. ¿Qué sucedería si se utilizará agua destilada en lugar del tampón de electroforesis en la cámara de electroforesis o en la solución del gel de agarosa? Como el agua destilada no contiene iones esto reducirá la conductividad del fluido y la movilidad de las moléculas a migrar en el gel. El tampón sirve como conductor de la electricidad y controla el pH, lo cual es importante para la estabilidad de las moléculas biológicas.

PREGUNTA 4. ¿El ADN hacia qué electrodo migrará? 

Solución: Como el ADN tiene una carga negativa a pH neutro migrará a través del gel hacia el electrodo positivo durante la electroforesis.

PREGUNTA 5. ¿En qué consiste un marcador de peso molecular para cromatografía de agarosa?

PREGUNTA 6. ¿Por qué el buffer de carga tiene glicerol? ¿Qué ocurre si cuando preparamos buffer de carga no le añadimos glicerol? ¿Para qué tiene colorante el buffer de carga?

PREGUNTA 7. ¿Por qué utilizamos SYBR® Gold Nucleic Acid para teñir los geles de agarosa en vez del bromuro de etidio que es más barato?

PREGUNTA 8. Unos alumnos hicieron un gel 1% de agarosa en TAE 1x. Cuando tuvieron que añadir 400 ml en la cubeta de electroforesis de TAE 1x se dieron cuenta de que no había TAE 1x así que prepararon 500ml de TAE 1X a partir de un stock de TAE 50x. Este dato es importante como vamos a ver en la solución. Al poner las muestras en el gel y poniendo el campo eléctrico a 100V durante 30 minutos observamos que las muestras no entran en el gel y que la pantalla pone LOAD.

En el manual de la cubeta de electroforesis hay una sección de errores. En los manuales siempre hay una sección de posibles errores (en inglés "Troubleshooting") con sus posibles soluciones.

¿Cuál pudo ser el error? ¿Cuál la solución?

Solución: aunque parezca mentira, el alumno hizo la solución 1X TAE a partir de una solución concentrada 50X TAE añadiendo "10 ml" entre comillas de 50XTAE en 490 ml de agua destilada. El problema fue que midió los 10 ml con el tapón de la botella de 50XTAE y viendo que enrasaba a 500 ml. Esta es una manera imprecisa de medir una solución concentrada. Imaginemos que en vez de 10 ml por imprecisión ha añadido 12 ml de 50XTAE. 

Ci x Vi = Cf x Vf

50X x 12 ml = Cf x 500 ml. Despejamos y vemos que la concentración final es de 1.2X en vez de 1X. Este es un error de 20% más de sales. Entonces tendremos que el gel se hizo con una solución TAE 1x hecha anteriormente y posiblemente a 1X y un TAE 1.2x que se añadió para correr el gel. Por ese motivo nos salta el aviso de LOAD, es decir, hay diferencias de sales entre el gel y el TAE que llena la cámara de electroforesis

PREGUNTA 9. Un grupo de alumnos hace una PCR y corre el resultado en un gel 1% de agarosa en TAE. Este es el resultado:

Solución: el gel que se ha hecho no es de muy buena calidad porque las bandas del marcador de peso molecular se ven borrosas. Puede ser que no se haya mezclado bien el agar con el TAE. Que la concentración del TAE que llena la cubeta y el TAE con el que se hizo el gel no tengan la misma concentración. No se observan bandas de la PCR. Esto puede ser por varias razones, que los alumnos se hayan olvidado de poner el ADN que se quería amplificar, que los reactivos estuviesen en mal estado, que se hayan equivocado con los microlitros que había que añadir.

PREGUNTA 10. Un grupo de alumnos hace una PCR y corre el resultado en un gel 1% de agarosa en TAE. Este es el resultado:

Solución: la misma que la pregunta 9 solo que aquí el gel es de mejor calidad porque se observan varias bandas del marcador de peso molecular. Comparar con el primer gel de esta clase que se muestra más arriba en el que se distinguen las bandas del marcador perfectamente

PREGUNTA 11.  Hacemos un gel de agarosa. Hay dos posibilidades a la hora de poner el gel en la cubeta. ¿Hacia dónde se orientarán los pocillos? ¿A o B?

PREGUNTA 12: Un grupo de alumnos hace una PCR y corre el resultado en un gel 1% de agarosa en TAE. Este es el resultado:

Solución: el gel que se ha hecho no es de muy buena calidad porque las bandas del marcador de peso molecular se ven borrosas. Se observa que en las muestras hay una curvatura en forma de sonrisa. Esto indica que o bien el gel se corrió a demasiado voltaje o bien que el gel no está correctamente hecho. Puede ser que no se haya mezclado bien el agar con el TAE. Que la concentración del TAE que llena la cubeta y el TAE con el que se hizo el gel no tengan la misma concentración. No se observan bandas de la PCR. Esto puede ser por varias razones, que los alumnos se hayan olvidado de poner el ADN que se quería amplificar, que los reactivos estuviesen en mal estado, que se hayan equivocado con los microlitros que había que añadir.