El DNA aislado idealmente usando el kit de extracción de invitrogen tendrá un valor >1.80 al cuantificarla en un espectrofotómetro con una absorbancia
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cuando las muestras están diluidas en el eluyente (Tris-HCl pH 7.5) lo cual indica que el DNA está razonablemente limpio de proteínas que pudiesen intervenir con aplicaciones siguientes. La ausencia de RNA contaminante se podría confirmar al realizar una electroforesis en gel de agarosa
Aparatos, equipos e instrumentos
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Cantidad
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Requisitos técnicos
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| Vórtex | 1 | |
| Juegos de micropipetas (10, 200, 1000 ul) | 3 | calibradas |
| Centrífuga | 1 | calibrada |
| Microcentrífuga | 1 | calibrada |
| Balanza analítica | 1 | calibrada |
| Baño maría | 1 |
Materiales
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Cantidad
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Especificaciones
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Tubos
eppendorf
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20
unidades c/u
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0,2-0,5-1
ml
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Gradillas
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3
unidades
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Para
tubos eppendorf
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Guantes
de látex
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30
pares
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Talla
M y L
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Guardianes
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3
unidades
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Puntas
de micropipeta
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1
rack c/u
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0,2-0,5-1
ml
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Jeringuilla/
vacuntainer
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6
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5
ml
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Tubos
EDTA
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6
|
5
ml
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Toallas
de papel
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30
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Torundas
de algodon
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30
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Torniquete
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6
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Reactivos
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Cantidad
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Especificaciones
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Agua
MiliQ
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100
ml
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Etanol
frío
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100
ml
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99%
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Isopropanol
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100
ml
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99%
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Reactivo
Purelink Genomic DNA kit Invitrogen
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7
Reacciones
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EXTRACCIÓN CON EL KIT PURE LINK GENOMIC MINI PREP (INVITROGEN)
El procedimiento de purificación de ADN está diseñado para purificar ADN genómico utilizando un procedimiento asado en centrifugación de columnas las cuales poseen carga específica para atraer el ADN.
Lisis
1 Calentar el baño maría a 55ºC. En un tubo eppendorf de 1,5ml colocar 200ul de sangre periférica con EDTA
2 Añada 20ul de proteinasa K y 20ul de RNAsa A. Vortex breve y se incuba 2 minutos a temperatura ambiente.
3 Añada 200ul del buffer de lisis. Mezcle usando vórtex. Incubar a 55ºC por 10minutos
4 Anadir 200ul de etanol 100%. Mezclar usando vórtex hasta obtener una solución homogénea
Unión del ADN a la columna
5 Añadir el lisado anterior (≈640ul) a la columna. Centrifugar la columna a 10000xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. Desechar el tubo de colección y colocar la columna en un tubo colector limpio
Lavado
6 Añadir 500ul de buffer de lavado 1. Centrifugar la columna a 10000xg durante 1 minuto a temperatura ambiente
7 Desechar el tubo de colección y colocar la columna en un tubo colector limpio. Añadir 500ul del buffer de lavado 2
8 Centrifugar la columna a máxima velocidad durante 3 minuto a temperatura ambiente
Elución del ADN
9 Colocar la columna en un tubo eppendorf de 1,5ml estéril y rotulado. Añadir de 25 a 200ul del buffer de elución a la columna. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto
10 Centrifugar a máxima velocidad por 1 minuto a temperatura ambiente
Conservación del ADN
Colocar el ADN purificado a -20ºC.
PREGUNTAS:
¿Qué función cumple la proteinasa K?
¿Qué función cumple la RNasa A?
De acuerdo a la literatura, ¿Qué función cumple el Genomic Lysis / Binding Buffer?
¿Qué función y componentes considera que constituyen el Wash Buffer?
¿Para qué se utiliza el Genomic Elution Buffer, cual es el fundamento de su acción?
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