Replicación ADN, telómeros y PCR (ejercicios)

La replicación es la máquina de hacer copias de uno mismo

 

La replicación del ADN es un proceso bidireccional y semiconservativo

 

PREGUNTA: a) ¿A qué sitio (A, B o ambos) puede unirse el primer 5' CAAGG 3' para iniciar la replicación? b) Si un primer se une a la secuencia A ¿Cuál es la dirección de elongación (izquierda o derecha)? c) En la hebra de la posición A la síntesis de ADN se lleva a cabo de un modo continuo o discontinuo?. d) ¿Qué fragmento se sintetiza primero C o D? Aviso: el cuadrado negro representa a la ADNpolimerasa

Solución: a) Solo se puede unir a la secuencia B. La razón es que el extremo 3´ del primer tiene que estar a la derecha para que tenga la orientación correcta. Si te fijas, en los fragmentos C y D el cuadrado negro que representa a la ADN polimerasa está a la derecha. La ADN polimerasa siempre se sitúa en el extremo 3´del ADN. b) Izquierda c) Discontinua d) Fragmento de Okazaki D

PCR: La replicación en tubo

Las enzimas de restricción cortan el ADN

Los telómeros previenen el cáncer en las células somáticas

A diferencia de los cromosomas bacterianos, los cromosomas de eucariontes son lineales (con forma de bastón), lo que significa que tienen extremos. Estos extremos representan un problema en la replicación del ADN. Justo en los extremos del cromosoma, el ADN no se puede copiar completamente en cada ronda de replicación y por resultado se observa un lento y gradual acortamiento del cromosoma

En general, las ADN polimerasas no pueden iniciar una nueva cadena de ADN desde cero, incluso si se les da un molde. Eso es porque para la reacción de polimerización que catalizan se necesita asociar el grupo fosfato de un nucleótido entrante con el grupo hidroxilo de un nucleótido existente (uno que ya sea parte de la cadena), como se muestra a la derecha. Sin este grupo hidroxilo que sirve como "gancho", la ADN polimerasa no tiene nada sobre lo cual unir nucleótidos y no puede catalizar su reacción para hacer ADN nuevo.

Los telómeros aparecen como puntos brillantes en los extremos de cada cromosoma. Los telómeros son secuencias TTAGGG repetidas cientos o incluso miles de veces. Fuente

La mayoría de los cebadores al inicio de los fragmentos de Okazaki pueden sustituirse sin problemas. Eso es porque la ADN polimerasa puede utilizar el hidroxilo en el extremo del fragmento de Okazaki vecino para iniciar, lo que permite sustituir el cebador por ADN. Sin embargo, al final del cromosoma no hay ningún fragmento de Okazaki vecino que proporcione el hidroxilo necesario, lo que resulta en una replicación incompleta del extremo del cromosoma.

Gracias a estos problemas, parte del ADN al final de un cromosoma eucarionte se deja sin copiar en cada ronda de replicación y se producen proyecciones de cadena sencilla. Tras múltiples rondas de división celular, el cromosoma se volverá más y más corto conforme este proceso se repite.

1 PREGUNTA: La secuencia de 102 nt de ADN de abajo se digiere con las enzimas de restricción EcoRI, AfaI, SalI y HindIII, en las combinaciones que se pueden ver en los pocillos del gel de agarosa. Cuando se realiza una electroforesis de esta digestión enzimática ¿Cómo quedarían las bandas de ADN?

5’GGAATTTCGCCGGCGATTATTAGGAATTCAGGCCACGTCGACTAGTACCGTCAAGGTTATATCTAACCCTTGTACAGGTCCGTACGCCATGCGCGATGTTAC 3'

 

2 PREGUNTA: Un plásmido de 6211 pb tiene dianas de restricción XbaI en las posiciones 0, 253 y 3050. Dianas de restricción SmaI en 1024, 4331. Si cortamos el plásmido con ambas enzimas y corremos la digestión enzimática en una cromatografía de agarosa. ¿Cuál es el carril correcto?

 

3 PREGUNTA:
a) Identifica el ORF en esta secuencia de ADN

5' TATGTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGTCACGTATTTCATGCGCGATGG 3'

4 PREGUNTA:

a) Identifica el ORF en esta secuencia de ADN

5' TATGTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGTCACGTATTTCATGCGCGATGG 3'

b) ¿Cuántos nucleótidos codificantes tiene este gen?

5 PREGUNTA: Partiendo de la secuencia de abajo, cuando el sistema de corrección de copia arregla la mutación o las mutaciones ¿Cuál será la secuencia resultante? ¿Qué papel juegan los metilos en todo el proceso? (La hebra de nueva síntesis es la negra) ¿Cómo afecta la mutación al diámetro del ADN? ¿Afectan todas las mutaciones por igual?

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5´     ATTGCT ATCTAGCATCGCAGCGTACGCGACGACTGCATCAGTCAT  3´
3´     TAACGATAGATGGTAGCGTCGCATGCGCT GCTGACGTCGTCAGTA 5´
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6 PREGUNTA: Las siguientes bases nitrogenadas ¿Son purinas o pirimidinas? ¿Por qué los pares de bases nitrogenadas comprenden siempre una purina enfrentada a una pirimidina?

¿Por qué el ARN tiene uracilo? ¿Por qué en el ADN, en vez de uracilo, tenemos timina?

7 PREGUNTA:  Tenemos un cromosoma bacteriano (covalentemente cerrado y circular) formado por una cadena de ADN tipo B de 7.700.000 pares de bases. Comienza la replicación y la horquilla de replicación comprende 270.000 pares de bases. ¿Cuántos pares de bases por entrecruzamiento existen en el ADN en esta nueva configuración?

8 PREGUNTA:  En este fragmento de doble cadena de ADN nombra las bases nitrogenadas implicadas y los extremos 5´y 3´ del esqueleto covalente. Las bases nitrogenadas púricas y pirimidínicas de distintas cadenas que se encuentran enfrentadas ¿Por qué tipo de enlace químico están unidas?

9 PREGUNTA:  Tenemos un cromosoma bacteriano de 4.222.845 pares de bases. Si la DNApol tiene una procesividad (capacidad de añadir nuevos nucleótidos al extremo 3´de la cadena que se está sintetizando) de 1000 nucleótidos por segundo. ¿Cuánto tardará este cromosoma en replicarse?

10 PREGUNTA: Cuando se rompe el enlace fosfodiester de una cadena de ADN ¿Se repara por una enzima? Si es que se regenera por enzima ¿Cuál se su nombre? o por lo contrario ¿Se regenera espontáneamente?

11 PREGUNTA: Imaginemos dos bacterias imaginarias. Ambas tienen cromosomas del mismo tamaño, por ejemplo 8.000.000 de pares de bases. Si la bacteria A tiene una DNApolIII con una capacidad procesiva de 500 nt por segundo, y la bacteria B tiene una DNApolIII con una capacidad procesiva de 1000 nt por segundo. ¿Cuál de las dos va a tener más descendencia? ¿Qué trascendencia evolutiva tendrá este hecho?

12 PREGUNTA: Si tengo una cromosoma lineal de 20 millones de pares de bases con 4 orígenes de replicación. Si la DNApolIII tiene una capacidad procesiva de 1000 nt por segundo ¿Cuánto tiempo tarda este cromosoma en replicarse?

13 PREGUNTA: Se ha cortado con PstI un plásmido bacteriano circular que contiene un gen de resistencia a la ampicilina. Tras la electroforesis se observa una banda de 20 Kb. ¿Qué deducirías de los resultados que se plantean a continuación?

a) Con EcoRI, el plásmido se corta en dos fragmentos: uno de 11.5 Kb y otro de 8.5 Kb
b) La digestión PstI+EcoRI genera tres fragmentos de: 6 Kb, 5.5 Kb y 8.5 Kb
c) El ADN del plásmido cortado con PstI se ha mezclado y ligado con fragmentos de ADN cortados con PstI. Todos los clones recombinantes son resistentes a la ampicilina.
d) Tras cortar uno de los clones recombinantes con PstI se obtienen dos fragmentos: 20 Kb y 6 Kb.
e) El clon anterior se corta con EcoRI y se obtienen 10 Kb, 8.5 Kb y 7.5 Kb. 

Respuesta

a) Al sumar los fragmentos 11.5 Kb + 8.5 Kb nos da un valor de 20 Kb. Este valor es coincidente con el fragmento generado con PstI, lo que significa que el plásmido tiene un tamaño de 20 Kb y que, por tanto, PstI lo corta una sola vez mientras que EcoRI tiene dos dianas dentro de la molécula circular.

b) Con la digestión doble podemos, ahora, obtener un mapa de restricción de esta molécula circular. Podemos deducir que el fragmento de 11.5 Kb generado por EcoRI, es cortado en dos fragmentos menores de 6 Kb y 5.5 Kb por la enzima PstI: 

c) Al cortar con PstI, el plásmido se queda en forma lineal con extremos cohesivos para ese enzima. Al poner en contacto fragmentos de ADN cortados también con PstI junto con una enzima ligasa, los fragmentos, que tienen extremos complementarios, se ligan al plásmido y la molécula recirculariza con un inserto dentro de ella, obteniendo un plásmido recombinante. Si la diana para PstI estuviera dentro del gen de la ampicilina, el inserto “rompería” este gen, por lo que quedaría inactivo y las bacterias serían sensibles a la ampicilina. Por eso, podemos deducir que la diana para PstI no se encuentra dentro del gen de resistencia a la ampicilina.

d) Al cortar de nuevo con la enzima PstI, lo que estamos haciendo es separar nuevamente el plásmido del inserto, por lo que obtenemos un fragmento de 20 Kb correspondiente al plásmido y otro de 6 Kb que sería el tamaño del fragmento clonado.

e) Al aparecer un nuevo fragmento cuando cortamos con EcoRI el plásmido recombinante, que no aparecía en el plásmido bacteriano inicial, significa que existe una nueva diana para este enzima. La diferencia entre el plásmido bacteriano inicial y el plásmido recombinante, es la presencia del inserto de 6 Kb. Por eso, deducimos que el fragmento clonado tiene una diana para EcoRI y que se encuentra situada entre las dos dianas EcoRI separadas por 11,5 Kb.

14 PREGUNTA: Un fragmento lineal de ADN de 11Kb se corta por separado con las enzimas de restricción EcoRI y HaeIII y con una mezcla de ambas obteniéndose los fragmentos indicados a continuación. EcoRI: 6Kb, 3Kb y 2Kb; HaeIII: 7Kb y 4Kb; EcoRI+HaeIII: 5Kb, 3Kb, 2Kb y 1Kb. Dibujar el mapa de restricción de este segmento de ADN.

15 PREGUNTA:

5' TATGTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGTCACGTATTTCATGCGCGATGG 3'

a) Identifica el ORF en esta secuencia de ADN
b) ¿Cuántos nucleótidos codificantes tiene este gen?


Solución: 5´TATGTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGTCACGTATTTCATGCGCGATGG

          3´  AATATTTCAGCCTATAGATTGGGAACAGTGCATAAAGTA  5´


36 nt codificantes

16 PREGUNTA: En las siguientes horquillas de replicación hay un primer. Puede ser un primer de una cadena de síntesis continua o discontinua ¿Sabrías decir en los seis problemas a que cadena corresponde cada uno de esos primers de ARN? ¿Podrías decir a que extremo, 5'o 3', corresponden los marcados con un signo de interrogación?

Haz clic en la imagen de abajo para que se haga grande y así no ver las soluciones que se encuentran más abajo

Solución:

17 PREGUNTA: a) ¿A qué sitio (A, B o ambos) puede unirse el primer 5' CAAGG 3' para iniciar la replicación? b) Si un primer se une a la secuencia A ¿Cuál es la dirección de elongación (izquierda o derecha)? c) En la hebra de la posición A la síntesis de ADN se lleva a cabo de un modo continuo o discontinuo?. d) ¿Qué fragmento se sintetiza primero C o D? Aviso: el cuadrado negro representa a la ADNpolimerasa

Solución: a) Solo se puede unir a la secuencia B. La razón es que el extremo 3´ del primer tiene que estar a la derecha para que tenga la orientación correcta. Si te fijas, en los fragmentos C y D el cuadrado negro que representa a la ADN polimerasa está a la derecha. La ADN polimerasa siempre se sitúa en el extremo 3´del ADN. b) Izquierda c) Discontinua d) Fragmento de Okazaki D