Extracción de DNA de sangre periférica usando el método de salting out. Obtener DNA de buena calidad y cantidad a partir de sangre periférica humana. Esta práctica de laboratorio incluye la extracción de sangre periférica y la obtención de material genético para posterior análisis en el laboratorio de biología molecular.
Este protocolo se basa en una modificación comercial del protocolo de Miller y Dykes, 1988, que básicamente consta de unos lavados sucesivos con buffer de lisis de glóbulos rojos (Tris-HCl 10 mM pH 8, Tritón X 100 1 %, sacarosa 11 %). Luego, se lisan los nucleos con una solución de Tris-HCl 10 mM, NaCl 400 mM, EDTA 2 mM, Proteinasa K 0,1 mg/ ml y SDS 2 %. Las proteínas se eliminaron por precipitación salina con acetato de potasio 3 M y el DNA se precipitó con isopropanol y etanol 70 %. El DNA se conservó a -20 °C en agua destilada libre de DNasas hasta su utilización
Referencia: Miller S.A., Dykes D.D. y Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. 16(3): p.1215. 1988.
| Aparatos, equipos e instrumentos | Cantidad | Requisitos técnicos |
| Vórtex | 1 | |
| Juegos de micropipetas (10, 200, 1000 ul) | 3 | calibradas |
| Centrífuga | 1 | calibrada |
| Microcentrífuga | 1 | calibrada |
| Balanza analítica | 1 | calibrada |
| Baño maría | 1 |
Calidad de DNA
El DNA aislado idealmente usando el kit de extracción de invitrogen tendrá un valor >1.80 al cuantificarla en un espectrofotómetro con una absorbancia
/
cuando las muestras están diluidas en el eluyente (Tris-HCl pH 7.5) lo cual indica que el DNA está razonablemente limpio de proteínas que pudiesen intervenir con aplicaciones siguientes. La ausencia de RNA contaminante se podría confirmar al realizar una electroforesis en gel de agarosa
Materiales
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Cantidad
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Especificaciones
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Tubos
eppendorf
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20
unidades c/u
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0,2-0,5-1
ml
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Gradillas
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3
unidades
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Para
tubos eppendorf
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Guantes
de látex
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30
pares
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Talla
M y L
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Guardianes
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3
unidades
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Puntas
de micropipeta
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1
rack c/u
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0,2-0,5-1
ml
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Jeringuilla/
vacuntainer
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6
|
5
ml
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Tubos
EDTA
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6
|
5
ml
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Toallas
de papel
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30
|
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Torundas
de algodon
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30
|
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Torniquete
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6
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Reactivos
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Cantidad
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Especificaciones
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Agua
miliQ
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100
ml
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Etanol
frío
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100
ml
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99%
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Isopropanol
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100
ml
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99%
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Reactivo
Salting Out Wizard
|
7
Reacciones
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EXTRACCIÓN CON EL KIT WIZARD GENOMIC (PROMEGA)Para ver manual clica aquí
Lisis de Glóbulos Rojos
1 En un tubo eppendorf de 1,5 ml, combine 300 ul de sangre con 900 ul de Cell Lysis Solution y mezcle por inversión.
2 Incube por 10 minutos a T ambiente.
3 Centrifugue a 13,000–16,000 × g*; 20 seg
4 Descarte el sobrenadante, Vórtex breve al pellet.
Lisis de Núcleos y Precipitación de Proteínas
5 Adicione 300 ul de Nuclei Lysis Solution, Mezcle por inversión.
6 Adicione 100 ul de Protein Precipitation Solution; vórtex por 20 seg.
7 Centrifugue a 13,000–16,000 × g*; 3 minutos
Precipitación de DNA y Rehidratación del pellet
8 Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo, al que se le haya adicionado previamente 300ul de isopropanol. Mezcle suavemente para observar la madeja de ADN en formación.
9 Centrifugue a 13,000–16,000 × g*; 1 minuto
Discarte el sobrenadante, adicione 300 ul de etanol (same volume as isopropanol).
Centrifugue como en el paso 9.
10 Retire el etanol, y deje secar el pellet (10–15 minutes), a temperatura ambiente
Rehidrate el DNA en 100 ul de Agua MiliQ o buffer Tris EDTA pH7,3 por 1 hora a 65°C o de un día para otro a 4°C.
Los datos que se registrarán serán los obtenidos en la medición de calidad de DNA en el espectrofotómetro mediante el Qubit. Para obtener el manual clica aquí. Se deberá elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la rúbrica detallada en el punto 6 de la presente guía. El cuestionario correspondiente a esta práctica es el siguiente:
¿Por qué el buffer de lisis celular deja intactos los núcleos de las células?
¿Qué principio opera cuando usted agrega la solución de precipitación de proteínas? ¿Qué pasaría si se agregara una solución menos concentrada? (una décima parte de la que utilizó)
¿Qué sucede cuando se agrega el Isopropanol? ¿Qué pasaría si agrega el mismo volumen de etanol? ¿Qué pasaría si agrega 2,5 volúmenes de etanol?
¿Procede el ADN que extraemos de la sangre periférica de glóbulos rojos?
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Para acceder al MANUAL del Qubit PRESIONA AQUÍ
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Lectura de la muestra del control positivo = 6.32
Concentración ADN control positivo = 6.32 x 200 / 10 = 126.4 microgramos /ml
Lectura de la muestra alumno en el Qubit = 0.0555
Concentración ADN = 0.0555 X 200 / 10 = 1.11 microgramos/ml
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