Cuantificación de proteínas

Esta práctica de laboratorio comprende la elaboración de diluciones seriadas, a partir de una solución madre de BSA para construir una curva estándar de cuantificación de proteínas; la medición de la cantidad de proteínas de los extractos por el método de Bradford mediante espectrofotometría; y el cálculo de su concentración.

Aparatos, equipos e instrumentos                           Cantidad              Requisitos técnicos

Espectrofotómetro                                                            1                          calibrado

Balanza analítica                                                              1                          calibrada

Juego de Micropipetas (10, 100 y 1000 ul)                      5                           calibradas

Materiales                                                                Cantidad              Especificaciones

Celdas de espectrofotómetro                                          25          

Pipetas Pasteur de 1,5mL                                               10 unidades      

Guantes de látex                                                             20 pares              Talla S, M y L

Guardianes                                                                       3 unidades        

Puntas de micropipetas                                                   2 rack por cada una       

Tubos eppendorf de 1,5ml                                             12          

Cajas con hielo                                                                 5                        5x5cm aproximadamente

Papel aluminio  Medio rollo        

Reactivos                                                                  Cantidad              Especificaciones

PBS                                                                                  5ml       

BSA                                                                                 5mg      

Reactivo de Braford                                                        4 ml      

Agua destilada                                                               20 ml    

Muestra de proteínas extraídas 10ul cada grupo 

             

Descripción del procedimiento

Curva estándar con BSA:

• Para realizar la curva del estándar preparar por duplicado 5 diluciones medias en PBS de la proteína estandar (BSA) entre 20 mg/ml a 0 mg/ml. También incorporar a la curva el valor "blanco" (PBS solo).

• Realizar 2 diluciones seriadas de las muestras

Cuantificación de Proteínas:

• Colocar 200 μl del reactivo de Bradford en cada celda del espectrofotómetro que se va a utilizar.
• Incubar a temperatura ambiente por un mínimo de 5 minutos. Pasamos nuestras muestras a las celdas de espectrofotómetro.

Espectrofotómetro y celda de espectrofotómetro (en mis dedos). El punto rojo se ha dibujado para mostrar por donde atravesará la muestra el haz de luz

 • Medir la absorbancia a 595 nm en el espectrofotómetro

En la espectrometría de absorción, se compara la intensidad de un haz de luz medida antes y después de la interacción con una muestra. La absorbancia mide la cantidad de luz que ha "absorbido" las proteínas en la disolución. Si no tenemos proteínas la absorbancia será cero. De hecho podemos utilizar el tubo sin proteínas como blanco en el espectrofotómetro. La solución más concentrada de proteínas deberá tener una absorbancia sobre 0.9. Valores más altos de absorbancia dejan de tener una relación lineal con la concentración de proteínas.

• Con los valores obtenidos, construir la curva de calibración y calcular la concentración de nuestras muestras problema. Para ello podemos calcular la ecuación de una recta con excell

1 PREGUNTA¿Qué significa límite de linealidad en una curva de calibrado? ¿Qué significa límite detectable en un experimento de espectrofotometría?

Fuente

2 PREGUNTA: ¿Qué podemos hacer si la concentración de nuestra muestra excede el límite de linealidad?

3 PREGUNTA: ¿Qué función tiene el reactivo de Bradford en este experimento?

Solución: La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación de la unión de un colorante, el Azul de Coomassie G-250, a la proteína, comparando esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar albúmina de Suero Bovino (BSA)

4 PREGUNTA: ¿Por qué es mejor hacer una dilución seriada a simplemente tomar los microlitros de una solución stock concentrada y diluirlos?

5 PREGUNTA: La siguiente curva de calibrado está expresada por una ecuación A = mC + 0.058. ¿Cómo hacemos experimentalmente para reducir el valor 0.058 a cero?

6 PREGUNTA: Realiza la curva de calibrado con una dilución de BSA. La solución madre de BSA de la que partimos es de 200 mg/ml. El volumen final es de 1 ml. Para preparar la solución problema hemos cogido 25 ul del extracto proteico y le hemos añadido Bradford y PBS para llegar a un volumen final de 1 ml. Halla la media y extrapola la concentración de una muestra problema con una absorbancia de 0.6. 

7 PREGUNTA: Considerando que usted midió la absorbancia de cada una de las soluciones que preparó y construyó la siguiente curva, con su ecuación y valor de R . Calcule la concentración de proteínas de su muestra que presentó una absorbancia de 0.25nm

8 PREGUNTA:  La siguiente curva de calibrado está expresada por una ecuación A = 0.0911C + 1.0659. ¿Cómo el espectrofotómetro detecta 1.0659 si la concentración de proteína es cero?  ¿Cómo hacemos experimentalmente para reducir el valor 1.0659 a cero?