Extracción de proteínas

 Ojo: necesitaremos llevar a la práctica 10 gramos de hígado

Obtendremos un extracto de proteínas a partir de muestras biológicas mediante métodos de lisis y precipitación en frío

Aparatos, equipos e instrumentos	Cantidad	Requisitos técnicos
Microcentrífuga refrigerada	1	Para tubos eppendorf 1,5ml
Centrífuga refrigerada	1	Para tubos falcon de 15ml
Micropipetas (1000 ul)	5	calibradas
Balanza analítica	1	calibrada
Refrigeradora	1

Materiales	Cantidad	Especificaciones
Mortero con vástago	5
Pipetas Pasteur de 1,5mL	10 unidades
Guantes de látex	20 pares	Talla S, M y L
Guardianes	3 unidades
Puntas de micropipetas de 1000uL	3 rack
Tubos eppendorf de 1,5ml	12
Tubos falcón de 15ml	12
Cajas con hielo	5	5x5cm aproximadamente
Reactivos	Cantidad	Especificaciones
PBS	20 ml	Frío: NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4
Sulfato de amonio saturado	5 ml	Frío
Agua destilada	10 ml	Fría

Extracción de proteínas

1. Pesar 10g de muestra biológica (hígado o carne).
2. Colocar un trozo de tejido en el mortero sobre el hielo. Agregar 1500 μl PBS.
Homogeneizar con el vástago hasta disgregar el tejido.
De ser necesario agregar más PBS para seguir disgregando (anotar el volumen extra agregado)
Tomar el extracto líquido con micropipeta (utilizando p1000) evitando aspirar los trozos menos disgregados de tejido.
3. Centrifugar 15 minutos a 14.000 rpm a 4°C
4. Colocar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y conservar en hielo.

*PBS (buffer fosfato salino): NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH of 7,4

Precipitación con Sulfato de amonio

5. Realizar las diluciones de la solución saturada de SO4(NH4)2 indicadas a continuación:

% Solución saturada de Sulfato de amonio	0	70	30	100
Volumen de agua (ul)	500	150	350	-
Volumen de Sulfato de amonio saturado (ul)	-	350	150	500

6. Rotular en la tapa 4 tubos con el % de sulfato de amonio agregado y el Número de grupo de trabajo (ejemplo para el grupo 4: 30% G4) Agregar en cada uno 100 μl del extracto crudo de proteínas.
Agregar 100 μl de las diluciones de SO4(NH4)2 en le tubo correspondiente.
7. Agitar vigorosamente durante unos segundos
8. Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm.
9. Tomar los sobrenadantes obtenidos y pasar a un nuevo tubo con el mismo rótulo, y descartar el tubo con el pellet.
10. Conservar en hielo si se va a cuantificar y sino a -20°C.

PREGUNTAS DE REPASO:

1. ¿Por qué utilizamos sulfato amónico y no sal de cocina (NaCl)?
2. ¿Por qué el sulfato amónico ayuda a que las proteínas precipiten?
3. ¿Por qué se realiza todo el proceso de extracción de proteínas a 4°C?