Un hígado, cuatro experimentos de proteínas

 

Ojo: necesitaremos llevar a la práctica 10 gramos de hígado

Obtendremos un extracto de proteínas a partir de muestras biológicas mediante métodos de lisis y precipitación en frío

Aparatos, equipos e instrumentos	Cantidad	Requisitos técnicos
Microcentrífuga refrigerada	1	Para tubos eppendorf 1,5ml
Centrífuga refrigerada	1	Para tubos falcon de 15ml
Micropipetas (1000 ul)	5	calibradas
Balanza analítica	1	calibrada
Refrigeradora	1

Materiales	Cantidad	Especificaciones
Mortero con vástago	5
Pipetas Pasteur de 1,5mL	10 unidades
Guantes de látex	20 pares	Talla S, M y L
Guardianes	3 unidades
Puntas de micropipetas de 1000uL	3 rack
Tubos eppendorf de 1,5ml	12
Tubos falcón de 15ml	12
Cajas con hielo	5	5x5cm aproximadamente
Reactivos	Cantidad	Especificaciones
PBS	20 ml	Frío: NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4
Sulfato de amonio saturado	1.5 gr  en 5 ml	Frío
Agua destilada	10 ml	Fría

1    Extracción de proteínas

1. Pesar 10g de muestra biológica (hígado o carne).
2. Colocar un trozo de tejido en el mortero sobre el hielo. Agregar 1500 μl PBS.
Homogeneizar con el vástago hasta disgregar el tejido.
De ser necesario agregar más PBS para seguir disgregando (anotar el volumen extra agregado)
Tomar el extracto líquido con micropipeta (utilizando p1000) evitando aspirar los trozos menos disgregados de tejido.
3. Centrifugar 15 minutos a 14.000 rpm a 4°C
4. Colocar el sobrenadante en un tubo de 1,5 ml y conservar en hielo.

*PBS (buffer fosfato salino): NaCl 137 mM, Fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, pH of 7,4

2    Precipitación con Sulfato de amonio

1. Realizar las diluciones de la solución saturada de SO4(NH4)2 indicadas a continuación:

% Solución saturada de Sulfato de amonio	0%	21%	9%	30 %
Volumen de agua (ul)	500	150	350	-
Volumen de Sulfato de amonio saturado (ul)	-	350	150	500

2. Rotular en la tapa 4 tubos con el % de sulfato de amonio agregado y el Número de grupo de trabajo (ejemplo para el grupo 4: 30% G4) Agregar en cada uno 100 μl del extracto crudo de proteínas.
Agregar 100 μl de las diluciones de SO4(NH4)2 en le tubo correspondiente.
3. Agitar vigorosamente durante unos segundos
4. Centrifugar 10 minutos a 14.000 rpm.
5. Tomar los sobrenadantes obtenidos y pasar a un nuevo tubo con el mismo rótulo, y descartar el tubo con el pellet.
6. Conservar en hielo si se va a cuantificar y sino a -20°C.

3    Influencia de la superficie de la muestra del hígado en su acción enzimática

‐ Porción de hígado 1: Macerar + 3 mL de Peróxido de hidrógeno

‐ Porción de hígado 2: Dividir en trozos + 3 mL de Peróxido de hidrógeno

Cortamos el hígado en trozos. OJO, debe de pesar lo mismo que el hígado macerado. Lo importante en los experimentos es eliminar variables, por ese motivo debemos tener todo igual excepto que un hígado esté macerado y el otro en trozos 

‐ Comparar las reacciones de los dos montajes.

¿Cuál de las dos preparaciones de hígado descompondrá el H202 en agua y 02 más rápido? ¿Por qué?

4    Método de Biuret para cuantificar proteínas

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

Reactivo de Biuret (Ya está preparado)

Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y

6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita añadir 200 ml de

NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de

plástico. 

Estandar proteína

Diluye 100 mg de caseína en 5 ml de agua destilada

Añadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estándar y muestras problemas

preparadas como se indica en la Tabla III.

Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al

blanco. El color es estable 1 hora. 

Representa la curva estándar.

Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2. 

CONCEPTOS DE REPASO

No pongas todos los huevos en la misma cesta

Esta frase significa que tenemos que diversificar el riesgo. Por ejemplo, tenemos un macerado de hígado. Si utilizamos todo el hígado para un experimento y el experimento sale mal, entonces toca volver a macerar. Si maceramos el doble de lo que necesitamos, si por lo que sea, el experimento sale mal, ya no tenemos que volver a macerar, porque hemos guardado un resto de hígado macerado que podemos utilizar. Debemos planear el experimento teniendo esto en cuenta. Otro ejemplo, necesitamos 4 tubos con 500 ul de extracto proteico. Si preparamos en vez de 2000 ul de extracto proteico, 10000 ul entonces tenemos no solamente para repetir, sino para dar a otros compañeros. De esa manera, evitamos estar tres clase macerando hígado porque nos hemos quedado sin extracto de proteínas.

Cómo hacer una solución saturada de 30% de amonio sulfato

30% significa 30 gramos de la sal en 100 ml de agua. Como voy a necesitar poco volumen puedo pesar 3 gr de amonio sulfato y ponerlos en un vaso de precipitados. En ese recipiente voy a poner 5 ml. Diluyo la sal y añado la disolución a una probeta. Enraso con agua destilada hasta alcanzar los 10 ml.

PREGUNTAS DE REPASO:

PREGUNTA 1. ¿Por qué utilizamos sulfato amónico y no sal de cocina (NaCl)?

Solución: El sulfato de amonio es una sal inorgánica con una alta solubilidad que se disocia en dos iones, amonio (NH4+) y sulfato (SO42−) en soluciones acuosas. El sulfato de amonio es especialmente útil como precipitante porque es altamente soluble, estabiliza la estructura de la proteína, tiene una densidad relativamente baja, está fácilmente disponible y es relativamente económico.

PREGUNTA 2. ¿Por qué el sulfato amónico ayuda a que las proteínas precipiten?

Solución: pincha aquí

PREGUNTA 3. ¿Por qué se realiza todo el proceso de extracción de proteínas a 4°C?

Solución: pincha aquí

PREGUNTA 4. Tengo una recta de calibrado. ¿Por qué la recta en A y B se curva?

Solución: pincha aquí

PREGUNTA 5: Si dos variables Y y X tienen esa relación en donde si Y=1, entonces X=2. Si X = 1 ¿Cuánto será Y? 

Solución: Y = 0.5

PREGUNTA 6: A partir del punto B, si añadimos más cantidad de proteína ¿Por qué no sube la variable Y?

PREGUNTA 7: En la siguiente recta de calibrado Y=0.249X + 0.1149

Si nuestra muestra problema tiene una absorbancia Y = 0.66. ¿Cuánta proteína (X) tendremos?

Solución: 2.18

PREGUNTA 8:¿Qué significa límite de linealidad en una curva de calibrado? ¿Qué significa límite detectable en un experimento de espectrofotometría?

Fuente

PREGUNTA 9: ¿Qué podemos hacer si la concentración de nuestra muestra excede el límite de linealidad?

Solución: pincha aquí

PREGUNTA 10: ¿Qué función tiene el reactivo de Biuret en este experimento?

Solución: Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas

PREGUNTA 11: ¿Por qué es mejor hacer una dilución seriada a simplemente tomar los microlitros de una solución stock concentrada y diluirlos?

Solución: por que es imposible tomar volúmenes muy pequeños, por debajo de 2 ul con una pipeta. Me explico. Tenemos una solución y quiero hacer diluciones 1/10. Si en vez de hacer una dilución seriada tomo los volúmenes con una pipeta veremos lo que pasa. Si el volumen final es 1 ml. Tomo 100 ul de la solución que quiero diluir y le añado 900 ul de agua destilada. Si quiero tener una dilución 1/100, tomo 10 ul del soluto y 990 ul. Si quiero una dilución 1/1000, tengo que añadir

PREGUNTA 12: La siguiente curva de calibrado está expresada por una ecuación A = mC + 0.058. ¿Cómo hacemos experimentalmente para reducir el valor 0.058 a cero?

Solución:  taramos el espectrofotómetro. En el caso de nuestro espectrofotómetro presionamos la tecla Cal de calibrado. La razón es que hacemos que la muestra con 0 ug de proteína equivalga a 0 absorbancia. Cuando la recta atraviesa el eje Y por el punto 0 la recta está representada por la ecuación Y = mX, siendo m la pendiente de la recta.

PREGUNTA 13: Realiza la curva de calibrado con una dilución de BSA. La solución madre de BSA de la que partimos es de 200 mg/ml. El volumen final es de 1 ml. Para preparar la solución problema hemos cogido 25 ul del extracto proteico y le hemos añadido Bradford y PBS para llegar a un volumen final de 1 ml. Halla la media y extrapola la concentración de una muestra problema con una absorbancia de 0.6.

PREGUNTA 14: Considerando que usted midió la absorbancia de cada una de las soluciones que preparó y construyó la siguiente curva, con su ecuación y valor de R . Calcule la concentración de proteínas de su muestra que presentó una absorbancia de 0.25

Solución: La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuación y = mx + b. Conjuntamente, los datos experimentales permiten calcular y justificar la linealidad mediante el coeficiente de determinación (R2), este último debe ser mayor a 0,995 (R2>0,995). 

0.25 = 0.04X + 0.02; 0.25-0.02 = 0.04X; 0.23/0.04 = X; X = 5.75 mg/ml

PREGUNTA 14: La siguiente curva de calibrado está expresada por una ecuación A = 0.0911C + 1.0659. ¿Cómo el espectrofotómetro detecta 1.0659 si la concentración de proteína es cero? ¿Cómo hacemos experimentalmente para reducir el valor 1.0659 a cero? Explica el porqué

Solución: taramos el espectrofotómetro. En el caso de nuestro espectrofotómetro presionamos la tecla Cal de calibrado. La razón es que hacemos que la muestra con 0 ug de proteína equivalga a 0 absorbancia. Cuando la recta atraviesa el eje Y por el punto 0 la recta está representada por la ecuación Y = mX, siendo m la pendiente de la recta.

PREGUNTA 15: ¿Por qué cuando trabajamos con proteínas utilizamos PBS o suero salino en vez de agua destilada?

Solución: Cuando trabajamos con proteínas, utilizamos soluciones como PBS (solución salina tamponada con fosfato) o suero salino en lugar de agua destilada por varias razones:

1    Estabilidad de las proteínas: Las proteínas son sensibles a cambios en el pH y la concentración de iones. PBS y soluciones salinas ayudan a mantener un ambiente estable que puede prevenir la desnaturalización de las proteínas.

2    Iones y osmolaridad: Las soluciones salinas proporcionan un entorno isotónico, lo que evita que las células o las proteínas se deshidraten o se hinchen. El equilibrio osmótico es crucial para la estabilidad estructural de las proteínas.

3    Interacciones biomoleculares: Los iones presentes en soluciones como PBS pueden influir en las interacciones entre proteínas y otros biomoléculas, lo que es esencial para muchas reacciones bioquímicas.

4    Tamponamiento: PBS actúa como un tampón, ayudando a mantener un pH constante durante experimentos que pod

rían causar fluctuaciones en el pH.

5 Compatibilidad biológica: el PBS tiene la misma cantidad de sales que tiene el suero humano, entonces cuando usamos esta solución, las proteínas van a estar en un ambiente salino similar al que tienen en el cuerpo humano. Esto es fundamental en aplicaciones como cultivos celulares o ensayos bioquímicos

En resumen, el uso de PBS o soluciones salinas garantiza un entorno óptimo para trabajar con proteínas, protegiendo su estructura y función.

PREGUNTA 16: Una alumna va a introducir un tubo eppendorf en la microfuga (centrífuga para tubos Eppendorf) ¿Qué error ves ahí?

PREGUNTA 17: Un alumno va a centrifugar estos dos tubos en una centrífuga. ¿Qué error ves?

PREGUNTA 18: Un tubo de centrífuga tiene 1 gr de descompensación. Si se centrifuga con 14000 xg ¿Cuánto pesará a esa fuerza de gravedad?

Solución: 14 kg

PREGUNTA 19: Voy a preparar 10 ml de una solución saturada de amonio sulfato 30%. Añado 3 gr de amonio sulfato a 10 ml de agua destilada. ¿Qué he hecho mal y por qué?

Solución: leer la práctica

PREGUNTA 20: Tengo 4 tubos con A 500 ul de agua destilada; B 500 ul solución amonio sulfato al 10%; C 500 ul de solución amonio sulfato 20% y D 500 ul de solución amonio sulfato 30%. A cada uno de estos 4 tubos añado 200 ul de un extracto de proteína. Los centrifugo. ¿Cuál de los cuatro tubos va a tener un mayor precipitado de proteínas y por qué?

Solución: el tubo D porque tiene iones amonio y sulfato. El tubo A, que tiene agua solamente, tendrá una precipitación de proteínas muy baja

PREGUNTA 21: ¿Qué reacción cataliza la enzima catalasa? 

Respuesta incorrecta: la enzima catalasa reacciona catalizando sustratos catalíticos

Solución: Para responder correctamente a la pregunta ¿Qué reacción cataliza la enzima catalasa? debemos responder: 1 ¿Qué es esa enzima? 2 ¿Qué hace esa enzima? 3 ¿Para qué sirve esa enzima? Por ejemplo:

La catalasa es una enzima óxido-reductasa que convierte el peróxido de hidrógeno a oxígeno y agua de acuerdo con la siguiente reacción: 

2H2O2 + catalasa --> 2H2= + O2

 Esta enzima está involucrada en la defensa contra daño oxidativo por peróxido de hidrógeno .

Los ejercicios de ORF, polipéptidos... los podéis encontrar en: 

Ejercicios traducción y proteínas

Y si queréís saber más:

https://actuaciencia.blogspot.com/2018/12/practica-10-extraccion-de-proteinas.html

https://actuaciencia.blogspot.com/2018/12/ejercicios-traduccion-y-proteinas.html

https://actuaciencia.blogspot.com/2018/06/practica-de-enzimas-catalisis-y-cinetica.html

https://actuaciencia.blogspot.com/2018/12/practica-11-cuantificacion-de-proteinas.html

https://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2022/10/como-hacer-diluciones-seriadas.html

Tablas de aminoácidos y código genético