Obtendremos un extracto de proteínas a partir de muestras biológicas mediante métodos de lisis y precipitación en frío
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
Añadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estándar y muestras problemas
preparadas como se indica en la Tabla III.
Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.
Representa la curva estándar.
Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2.
CONCEPTOS DE REPASO
No pongas todos los huevos en la misma cesta
Esta frase significa que tenemos que diversificar el riesgo. Por ejemplo, tenemos un macerado de hígado. Si utilizamos todo el hígado para un experimento y el experimento sale mal, entonces toca volver a macerar. Si maceramos el doble de lo que necesitamos, si por lo que sea, el experimento sale mal, ya no tenemos que volver a macerar, porque hemos guardado un resto de hígado macerado que podemos utilizar. Debemos planear el experimento teniendo esto en cuenta. Otro ejemplo, necesitamos 4 tubos con 500 ul de extracto proteico. Si preparamos en vez de 2000 ul de extracto proteico, 10000 ul entonces tenemos no solamente para repetir, sino para dar a otros compañeros. De esa manera, evitamos estar tres clase macerando hígado porque nos hemos quedado sin extracto de proteínas.
Cómo hacer una solución saturada de 30% de amonio sulfato
30% significa 30 gramos de la sal en 100 ml de agua. Como voy a necesitar poco volumen puedo pesar 3 gr de amonio sulfato y ponerlos en un vaso de precipitados. En ese recipiente voy a poner 5 ml. Diluyo la sal y añado la disolución a una probeta. Enraso con agua destilada hasta alcanzar los 10 ml.
PREGUNTAS DE REPASO:
PREGUNTA 1. ¿Por qué utilizamos sulfato amónico y no sal de cocina (NaCl)?
Solución: El sulfato de amonio es una sal inorgánica con una alta solubilidad que se disocia en dos iones, amonio (NH4+) y sulfato (SO42−) en soluciones acuosas. El sulfato de amonio es especialmente útil como precipitante porque es altamente soluble, estabiliza la estructura de la proteína, tiene una densidad relativamente baja, está fácilmente disponible y es relativamente económico.
PREGUNTA 2. ¿Por qué el sulfato amónico ayuda a que las proteínas precipiten?
PREGUNTA 3. ¿Por qué se realiza todo el proceso de extracción de proteínas a 4°C?
Solución:
pincha aquíPREGUNTA 4. Tengo una recta de calibrado. ¿Por qué la recta en A y B se curva
?
PREGUNTA 5: Si dos variables Y y X tienen esa relación en donde si Y=1, entonces X=2. Si X = 1 ¿Cuánto será Y?
Solución: Y = 0.5
PREGUNTA 6: A partir del punto B, si añadimos más cantidad de proteína ¿Por qué no sube la variable Y?
PREGUNTA 7: En la siguiente recta de calibrado Y=0.249X + 0.1149
Si nuestra muestra problema tiene una absorbancia Y = 0.66. ¿Cuánta proteína (X) tendremos?
Solución: 2.18
PREGUNTA 8:¿Qué significa límite de linealidad en una curva de calibrado? ¿Qué significa límite detectable en un experimento de espectrofotometría?
PREGUNTA 9: ¿Qué podemos hacer si la concentración de nuestra muestra excede el límite de linealidad?
Solución:
pincha aquíPREGUNTA 10: ¿Qué función tiene el reactivo de Biuret en este experimento?
Solución:
Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínasPREGUNTA 11: ¿Por qué es mejor hacer una dilución seriada a simplemente tomar los microlitros de una solución stock concentrada y diluirlos?
Solución: por que es imposible tomar volúmenes muy pequeños, por debajo de 2 ul con una pipeta. Me explico. Tenemos una solución y quiero hacer diluciones 1/10. Si en vez de hacer una dilución seriada tomo los volúmenes con una pipeta veremos lo que pasa. Si el volumen final es 1 ml. Tomo 100 ul de la solución que quiero diluir y le añado 900 ul de agua destilada. Si quiero tener una dilución 1/100, tomo 10 ul del soluto y 990 ul. Si quiero una dilución 1/1000, tengo que añadir
PREGUNTA 12: La siguiente curva de calibrado está expresada por una ecuación A = mC + 0.058. ¿Cómo hacemos experimentalmente para reducir el valor 0.058 a cero?
Solución:
taramos el espectrofotómetro. En el caso de nuestro espectrofotómetro presionamos la tecla Cal de calibrado. La razón es que hacemos que la muestra con 0 ug de proteína equivalga a 0 absorbancia. Cuando la recta atraviesa el eje Y por el punto 0 la recta está representada por la ecuación Y = mX, siendo m la pendiente de la recta.PREGUNTA 13: Realiza la curva de calibrado con una dilución de BSA. La solución madre de BSA de la que partimos es de 200 mg/ml. El volumen final es de 1 ml. Para preparar la solución problema hemos cogido 25 ul del extracto proteico y le hemos añadido Bradford y PBS para llegar a un volumen final de 1 ml. Halla la media y extrapola la concentración de una muestra problema con una absorbancia de 0.6.
PREGUNTA 14: Considerando que usted midió la absorbancia de cada una de las soluciones que preparó y construyó la siguiente curva, con su ecuación y valor de R . Calcule la concentración de proteínas de su muestra que presentó una absorbancia de 0.25
Solución: La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuación y = mx + b. Conjuntamente, los datos experimentales permiten calcular y justificar la linealidad mediante el coeficiente de determinación (R2), este último debe ser mayor a 0,995 (R2>0,995).
0.25 = 0.04X + 0.02; 0.25-0.02 = 0.04X; 0.23/0.04 = X; X = 5.75 mg/ml
PREGUNTA 14: La siguiente curva de calibrado está expresada por una ecuación A = 0.0911C + 1.0659. ¿Cómo el espectrofotómetro detecta 1.0659 si la concentración de proteína es cero? ¿Cómo hacemos experimentalmente para reducir el valor 1.0659 a cero? Explica el porqué
Solución:
taramos el espectrofotómetro. En el caso de nuestro espectrofotómetro presionamos la tecla Cal de calibrado. La razón es que hacemos que la muestra con 0 ug de proteína equivalga a 0 absorbancia. Cuando la recta atraviesa el eje Y por el punto 0 la recta está representada por la ecuación Y = mX, siendo m la pendiente de la recta.PREGUNTA 15: ¿Por qué cuando trabajamos con proteínas utilizamos PBS o suero salino en vez de agua destilada?
Solución: Cuando trabajamos con proteínas, utilizamos soluciones como PBS (solución salina tamponada con fosfato) o suero salino en lugar de agua destilada por varias razones:
1 Estabilidad de las proteínas: Las proteínas son sensibles a cambios en el pH y la concentración de iones. PBS y soluciones salinas ayudan a mantener un ambiente estable que puede prevenir la desnaturalización de las proteínas.
2 Iones y osmolaridad: Las soluciones salinas proporcionan un entorno isotónico, lo que evita que las células o las proteínas se deshidraten o se hinchen. El equilibrio osmótico es crucial para la estabilidad estructural de las proteínas.
3 Interacciones biomoleculares: Los iones presentes en soluciones como PBS pueden influir en las interacciones entre proteínas y otros biomoléculas, lo que es esencial para muchas reacciones bioquímicas.
4 Tamponamiento: PBS actúa como un tampón, ayudando a mantener un pH constante durante experimentos que pod
rían causar fluctuaciones en el pH.
5 Compatibilidad biológica: el PBS tiene la misma cantidad de sales que tiene el suero humano, entonces cuando usamos esta solución, las proteínas van a estar en un ambiente salino similar al que tienen en el cuerpo humano. Esto es fundamental en aplicaciones como cultivos celulares o ensayos bioquímicos
En resumen, el uso de PBS o soluciones salinas garantiza un entorno óptimo para trabajar con proteínas, protegiendo su estructura y función.
PREGUNTA 16: Una alumna va a introducir un tubo eppendorf en la microfuga (centrífuga para tubos Eppendorf) ¿Qué error ves ahí?
PREGUNTA 17: Un alumno va a centrifugar estos dos tubos en una centrífuga. ¿Qué error ves?
PREGUNTA 18: Un tubo de centrífuga tiene 1 gr de descompensación. Si se centrifuga con 14000 xg ¿Cuánto pesará a esa fuerza de gravedad?
Solución: 14 kg
PREGUNTA 19: Voy a preparar 10 ml de una solución saturada de amonio sulfato 30%. Añado 3 gr de amonio sulfato a 10 ml de agua destilada. ¿Qué he hecho mal y por qué?
Solución: leer la práctica
PREGUNTA 20: Tengo 4 tubos con A 500 ul de agua destilada; B 500 ul solución amonio sulfato al 10%; C 500 ul de solución amonio sulfato 20% y D 500 ul de solución amonio sulfato 30%. A cada uno de estos 4 tubos añado 200 ul de un extracto de proteína. Los centrifugo. ¿Cuál de los cuatro tubos va a tener un mayor precipitado de proteínas y por qué?
Solución: el tubo D porque tiene iones amonio y sulfato. El tubo A, que tiene agua solamente, tendrá una precipitación de proteínas muy baja
PREGUNTA 21: ¿Qué reacción cataliza la enzima catalasa?
Respuesta incorrecta: la enzima catalasa reacciona catalizando sustratos catalíticos
Solución: Para responder correctamente a la pregunta ¿Qué reacción cataliza la enzima catalasa? debemos responder: 1 ¿Qué es esa enzima? 2 ¿Qué hace esa enzima? 3 ¿Para qué sirve esa enzima? Por ejemplo:
La catalasa es una enzima óxido-reductasa que convierte el peróxido de hidrógeno a oxígeno y agua de acuerdo con la siguiente reacción:
2H2O2 + catalasa --> 2H2= + O2
Esta enzima está involucrada en la defensa contra daño oxidativo por peróxido de hidrógeno .
Los ejercicios de ORF, polipéptidos... los podéis encontrar en:
Ejercicios traducción y proteínas
Y si queréís saber más:
https://actuaciencia.blogspot.com/2018/12/practica-10-extraccion-de-proteinas.html
https://actuaciencia.blogspot.com/2018/12/ejercicios-traduccion-y-proteinas.html
https://actuaciencia.blogspot.com/2018/06/practica-de-enzimas-catalisis-y-cinetica.html
https://actuaciencia.blogspot.com/2018/12/practica-11-cuantificacion-de-proteinas.html
https://bacteriasactuaciencia.blogspot.com/2022/10/como-hacer-diluciones-seriadas.html
Tablas de aminoácidos y código genético
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