Electroforesis vertical de proteínas SDS-PAGE

Tema a desarrollar

La electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE es uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis y caracterización de proteínas. La técnica permite separar moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un campo eléctrico.

Objetivos de la práctica

Conocer la técnica de electroforesis de proteínas en geles SDS-PAGE.

Separar proteínas de un extracto mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida.

Teñir las proteínas separadas en el gel con azul de Coomasie y determinar su peso molecular.

Aparatos, equipos e instrumentos	Cantidad	Requisitos técnicos
pH-metro	1	calibrado
Agitador magnético	1
Balanzas de precisión	1	calibrada
Microcentrífuga	1	Para tubos eppendorf de 1,5ml
Equipo de electroforesis	1	con accesorios (sistema de montaje y preparación de geles, espaciadores para geles de 0,75 mm de espesor, peines para formar 10 pocillos, placas de cristal).
Fuente de electroforesis.	1
Termobloque	1	a 100°C
Agitador orbital.	1
Transiluminador.	1
Sistema de documentación	1

Materiales	Cantidad	Especificaciones
Rotulador indeleble.	2 unidades
Etiquetas adhesivas de papel.	2 unidades
Espátulas.	3 unidades
Tijeras.	2 unidades
Botellas de vidrio 100mL	5 unidades
Botellas de vidrio 1000mL	3 unidades
Papel de filtro.	4 unidades
Matraz 10ml	5 unidades
Vasos de precipitado y probetas (10 y 100 ml).	2 de cada una
Imán para agitación magnética.	2 unidades
Guantes	10 pares	Tallas S, M y L
Juego de micropipetas (1-10 μl, 10-100 μl y 100-1000 μl).	2 juegos
Puntas para juego de micropipetas	1 rack por cada una
Pipetas Pasteur de 1ml	5 unidades
Pipetas de vidrio 5ml	5 unidades
Peras de goma	2 unidades
Tubos eppendorf de 1,5 ml.	10 unidades
Gradillas para tubos eppendorf	1 unidad
Bandeja de plástico para el teñido de geles	1 unidad
Reactivos	Cantidad	Especificaciones
Extractos proteicos
Solución de acrilamida/bis-acrilamida 30%.	7ml	preparado comercial
Solución tampón para el gel separador Tris-HCl 1.5M pH 8.8	100ml	18.17g de Tris base en 80ml de agua destilada. Ajustar el pH con HCl y completar el volumen de 100ml con agua destilada.
Solución tampón para el gel ­­concentrador Tris-HCl 0.5M pH 6.8	100ml	6.05g de Tris base en 80ml de agua destilada. Ajustar el pH con HCl y completar el volumen de 100ml con agua destilada.
Persulfato amónico (APS) al 10%	10ml	10g de APS y completar con agua destilada hasta 10ml
Solución tampón de electroforesis Tris-Glicina pH8.3 10X	1L	30g de Tris base, 144g de glicina, 10g de SDS, 800ml de agua destilada y ajustar el pH con HCl.
Solución de tinción azul de Coomasie	1L	1 g de azul de Coomasie, 100ml de ácido acético, 400ml de metanol, completar con agua destilada hasta 1L
Solución decolorante de geles	1L	100ml de ácido acético, 400ml de metanol y 500ml de agua destilada.
Solución de SDS al 10%	3ml	10% peso/volumen
Glicerol.	1ml
Azul de bromofenol al 1%	1ml
2-Mercaptoetanol.	1ml
Glicina (forma ácida)	200g
TEMED (preparado comercial)	1ml
Marcador de peso molecular de proteínas	20ul
Agua destilada	2L

Descripción del procedimiento

Preparación del gel de poliacrilamida

En la presente práctica se va a preparar un mini-gel de 0,75 mm de espesor. Este consta de un gel concentrador de aproximadamente 2 cm de longitud que contiene los pocillos para cargar las muestras, y un gel separador de aproximadamente 6 cm. En la figura 1, se ilustra el montaje del sistema de electroforesis, la preparación de los geles y el procedimiento a seguir.

Se prepara el sistema de electroforesis mini-gel tal como se indica en la Figura 1 (b).

La acrilamida se polimeriza formando este tipo de estructuras que permiten la separación de proteínas por su peso molecular. OJO, la acrilamida es un producto carcinogénico. Por favor, leed la hoja de seguridad para el manejo de acrilamida

Preparación del gel separador al 13%

Se mezcla en un matraz (capacidad aproximada de 10 mL) los componentes en el orden siguiente:

2.5ml de Tampón Tris HCl 1.5M pH 8.8
0,1ml de SDS 10%
4.3ml de acrilamida bisacrilamida 30%
0.05ml de APS 10%
0.005ml de TEMED
agua destilada hasta completar 10ml.

Con cuidado, utilizando una pipeta Pasteur, se añade la mezcla en el interior del molde hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma que quede suficiente espacio para el gel concentrador (se debe calcular 1 cm más de la longitud de los pocillos del peine) (Fig 1, c).

A continuación, usando una pipeta limpia, se cubre la superficie del gel con agua destilada o con isopropanol. Esto previene el contacto del oxígeno con el gel que inhibe la reacción de polimerización (Fig 1, d).

La polimerización del gel debe de ocurrir en unos 30 minutos.

Preparación del gel concentrador al 3%

Se elimina el agua destilada o el isopropanol que cubre el gel separador, y se lava la parte superior del gel 2-3 veces con agua destilada para eliminar cualquier residuo de acrilamida no polimerizada. Se seca el líquido restante en la parte de superior del gel con papel de filtro con cuidado de no dañar el gel

Se mezcla en un matraz de 10 ml, los componentes en el orden siguiente:

2.5ml de Tampón Tris HCl 0.5M pH 6.8
0.1ml de SDS 10%
1ml de acrilamida bisacrilamida 30%
0.1ml de APS 10%
0.005ml de TEMED
agua destilada hasta completar 10ml.

Utilizando una pipeta Pasteur, se introduce la solución directamente sobre la superficie del gel separador (Fig 1, e). Inmediatamente se inserta el peine en la solución concentradora con cuidado para evitar que se formen burbujas de aire (Fig 1, f).

Se espera hasta que el gel haya polimerizado (aproximadamente 30 minutos).

Se retira el peine cuidadosamente con un movimiento vertical (Fig 1., g). Usando una botella de lavado, se enjuagan los pocillos 2-3 veces con agua destilada para eliminar cualquier resto de acrilamida.

Preparación de las muestras

En el tiempo de espera durante la polimerización se preparan las muestras que se van a cargar en el gel. Para preparar el tampón de carga se añaden en un matraz de 10ml los siguientes reactivos:

1ml de Tampón Tris HCl 0.5M pH 6.8
0.8ml de glicerol
1.6ml de SDS 10%
0.4ml de azul de bromofenol al 1%
0.4ml de 2-mercaptoetanol
3ml de agua destilada.

Con ayuda de una micropipeta se toman 10 μl del extracto proteico preparado en tampón de carga en un tubo eppendorf y se le añade 10 ul del tampón de carga. No se olvide preparar un tubo eppendorf con las proteínas estándar de peso molecular conocido. Se fijan las tapas de los tubos y se calientan en un termobloque a 100ºC durante 5 minutos. Se centrifugan 10 segundos a máxima velocidad para concentrar el volumen en el fondo del tubo porque al hervir el líquido está repartido por todo el tubo en forma de gotas.

Electroforesis

Se insertan las placas con los geles polimerizados en la unidad de electroforesis tal como se indica en la Figura 1 (h,i).

Se prepara el tampón de electroforesis 1X a partir de la solución concentrada 10X (se añaden 100ml de la solución concentrada 10X y 900ml de agua destilada en una botella de vidrio) y se añade en los reservorios interior y exterior (Fig 1, j). Se retiran, si las hubiera, las burbujas de aire y restos de acrilamida del interior de los pocillos, introduciendo tampón de electroforesis en los mismos.

Se aplican las muestras con ayuda de una micropipeta (hasta 20 μl) en los pocillos, en un orden predeterminado y previamente anotado (Fig 1, k). No se olvide añadir, en un carril, la solución de proteínas estándar, de peso molecular conocido. 

Se conectan los electrodos a la cubeta de electroforesis y a la fuente de alimentación y se aplica corriente eléctrica. La corriente eléctrica recomendada para geles de 0,75 mm de grosor es un voltaje constante de 100-200V (Fig 1, l,m,n).

La duración aproximada del proceso es de 40-45 minutos. Una vez acabada la electroforesis, cuando el frente de azul de bromofenol alcanza la parte inferior del gel, se desconecta la fuente de alimentación, retirándose los electrodos y sacando los geles de la cubeta de electroforesis. Estos se depositan en la mesa de trabajo (Fig 1, ñ).

Se sacan los geles de acrilamida del interior del molde, separando cuidadosamente con ayuda de una espátula ambos cristales (Fig 1, p). Se elimina el gel concentrador (Fig 1, q) y se hace una muesca al gel en una de las esquinas para orientar la posición de las muestras (por ejemplo en la esquina inferior contraria al patrón de proteínas).

Tinción del gel con azul de coomassie

Las bandas de proteínas, una vez terminada la electroforesis, se visualizan tiñendo los geles con una solución de azul de coomasie:

1). 2.5 g Azul Brillante Coomassie R-250
2). 450 mL metanol
3). 100 mL acido acetico glacial
4). Aforar a 1 L con agua BD
Nota: Esta solucion se puede recuperar y reusar nuevamente si se filtra y se mezcla con la solucion de coomassie

La tinción se realiza con agitación suave durante, al menos, 30 min.

Se trasfiere el gel de la placa de vidrio a un recipiente que contiene la solución de tinción de coomassie (Fig 1, r). Se deja el gel en agitación suave con suficiente volumen de esta solución a temperatura ambiente durante 1 hora. (Fig 1., s).

Se elimina la solución de tinción con una pipeta y se conserva para futuras
tinciones. Se añade solución decolorante

1). 200 mL de metanol
2). 150 mL de acido acetico
3). 650 mL de ddH20

y se incuba en agitación para eliminar el exceso de coloración hasta que sólo queden teñidas de azul las proteínas, cambiando la solución decolorante tantas veces como sea necesario. El gel puede estar en esta solución toda la noche pero se pueden empezar a observar las proteínas en 20 minutos.

Se elimina la solución de desteñido y se añade agua destilada (o acético al 10%). Los geles pueden conservarse de esta forma durante largos periodos de tiempo de forma casi indefinida a 4ºC.

Cuantificación por densitometría en gel SDS PAGE de la proteína His-GiNMNAT purificada. a. Gel SDS PAGE 12%: M: marcador de bajo peso molecular (kDa); 1: GiNMNAT (0,125 µl); 2: GiNMNAT (0,25 µl); 3: por densitometría GiNMNAT (0,5 µl); 4: BSA (2 µg/µl); 5: BSA (4 µg/µl); 6: BSA (6 µg/µl); 7: BSA (8 µg/µl); 8: BSA (10 µg/µl) teñido en Coomassie R. b. Tabla de datos densitométricos (18).  FUENTE

Tabla de equivalencias entre peso molecular, cantidad de proteína y capacidad de visualización entre las tres técnicas básicas de tinción. Para realizar conversiones masa/mol visitar el siguiente ENLACE

La acrilamida, una sustancia cancerígena que se encuentra en las papas fritas

EJERCICIOS

1. Describe al menos tres diferencias entre el gel de agarosa y el de acrilamida

2. ¿Qué papel tiene el betamercaptoetanol en la electroforesis de proteínas? ¿Qué pasaría si no pusiesemos este reactivo en la electroforesis?

3. ¿En la electroforesis de proteínas? ¿Qué papel tiene el gel apilador (stacking gel) y el separador? Cita al menos dos diferencias entre ambos.

4. ¿Por qué crees que la acrilamida es tóxica pero la poliacrilamida no?

5. Tenemos una muestra de anticuerpos. Corremos esta muestra en un gel de acrilamida en la que nos hemos olvidado poner SDS ¿Cuantas bandas de proteína se observarían en el gel? ¿Y si le añadimos SDS?

5. ¿Qué papel tiene el SDS en la electroforesis de proteínas?