Diseño de primers

Esta práctica de laboratorio incluye el análisis de la secuencia del gen a amplificar, el diseño bioinformático y selección del par de primers idóneo para la PCR a realizarse en la siguiente práctica en el laboratorio de biología molecular.

Requisitos previos a la realización de la práctica

Antes de comenzar la práctica, el estudiante deberá realizar una lectura sobre el diseño de primers para PCR y esta entrada del blog. También leer acerca de los principios de la replicación del ADN es útil.

Parámetros, magnitudes y rangos a ser determinados

Se registrará el código del Genbank del gen que queramos amplificar. Por ejemplo podemos entrar en el genoma de una cepa de Streptococcus pneumoniae:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE007317.1?report=fasta

Seleccionamos al azar una región de este genoma

Y buscamos ORF utilizando este programa:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/

Seleccionamos el ORF que queramos y hacemos un blast para ver si codifica para una proteína presente también en otros organismo similares

Se copiará en un documento Word. Se localizará el inicio y el final del gen. Se traducirá el gen en la página http://biomodel.uah.es/lab/cibertorio/analysis/trans.htm.

En el informe se registra el gen y la traducción a proteína. Los primers se escribirán 5`a 3` con la temperatura de anillamiento que estará comprendida entre los 68-62º. Los dos primers tendrán una temperatura de anillamiento comprendida entre los 68-62º. Se utilizará el programa http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html

PREGUNTA 1: ¿Por qué es importante que ambos primers tengan una temperatura de anillamiento similar?

PREGUNTA 2: ¿Por qué la temperatura de anillamiento es menor que la temperatura de polimerización?

PREGUNTA 3: ¿Por qué no se deben diseñar primers de 5 nucleótidos?

PREGUNTA 4:  Señala al menos tres ORF directos y tres reversos en el siguiente fragmento de genoma:

CGCAAACAAGATGTTAGCCAAATGCTCGTCATCCCAATTGATAAAATCCAAACTGAAGTTGGTAACTTTT

ATGGTGTTAGTATCAAAGAAATGAAGGGAAGTAGACGCCTTCAAAATATTGTTTTGGCCCGTCAAGTAGC

CATGTATTTATCTAGAGAACTAACAGATAATAGTCTTCCAAAAATTGGGAAGGAATTTGGGGGAAAAGAT

CATACCACAGTCATTCATGCCCATGCCAAAATAAAATCTTTGATTGATCAAGACGATAATTTACGTTTAG

AAATTGAATCAATCAAAAAGAAAATCAAATAATTTGTGGATAACTTTTAGTTTTTTATCTTTTTTATCCA

CATTTTTTAAACAAGCTAAAAAACTTGATAGGACTTGTTTAAAGGCTGTTTTCCACAGATTTCACAGACT

CTATTATTACTATTATCTTTCTAATACTAAAAATAAATAAAGGAGAATCCATGATTCATTTTTCAATTAA

TAAAAATTTATTTCTACAAGCATTAAATATTACTAAGAGAGCTATTAGTTCTAAAAATGCCATTCCTATT

Solución:

CGCAAACAAGATGTTAGCCAAATGCTCGTCATCCCAATTGATAAAATCCAAACTGAAGTTGGTAACTTTT

ATGGTGTTAGTATCAAAGAAATGAAGGGAAGTAGACGCCTTCAAAATATTGTTTTGGCCCGTCAAGTAGC

CATGTATTTATCTAGAGAACTAACAGATAATAGTCTTCCAAAAATTGGGAAGGAATTTGGGGGAAAAGAT

CATACCACAGTCATTCATGCCCATGCCAAAATAAAATCTTTGATTGATCAAGACGATAATTTACGTTTAG

AAATTGAATCAATCAAAAAGAAAATCAAATAATTTGTGGATAACTTTTAGTTTTTTATCTTTTTTATCCA

CATTTTTTAAACAAGCTAAAAAACTTGATAGGACTTGTTTAAAGGCTGTTTTCCACAGATTTCACAGACT

CTATTATTACTATTATCTTTCTAATACTAAAAATAAATAAAGGAGAATCCATGATTCATTTTTCAATTAA

TAAAAATTTATTTCTACAAGCATTAAATATTACTAAGAGAGCTATTAGTTCTAAAAATGCCATTCCTATT

ATGTTAGCCAAATGCTCGTCATCCCAATTGATAAAATCCAAACTGAAGTTGGTAACTTTT

ATGGTGTTAGTATCAAAGAAATGA 84 nt

ATGCTCGTCATCCCAATTGATAAAATCCAAACTGAAGTTGGTAACTTTTATGGTGTTAGTATCAAAGAAATGAAGGGAAGTAGACGCCTTCAAAATATTGTTTTGGCCCGTCAAGTAGCCATGTATTTATCTAGAGAACTAACAGATAATAGTCTTCCAAAAATTGGGAAGGAATTTGGGGGAAAAGATCATACCACAGTCATTCATGCCCATGCCAAAATAAAATCTTTGATTGATCAAGACGATAATTTACGTTTAGAAATTGAATCAATCAAAAAGAAAATCAAATAA 291 nt

TTAAAGGCTGTTTTCCACAGATTTCACAGACTCTATTATTACTATTATCTTTCTAATACTAAAAATAAATAAAGGAGAATCCAT 84 nt

TCATTTTTCAATTAATAAAAATTTATTTCTACAAGCATTAAATATTACTAAGAGAGCTATTAGTTCTAAAAATGCCAT 78 nt

PREGUNTA 5: Encuentra el ORF y amplifícalo con primers de 6 nt

5' TGTGTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGTCACGTATTTCATGCGCGATGG 3'

Solución:

Longitud ORF 39 nt

Primer 1: 5´TTATAA 3´

Primer 2: 5´ATGAAA 3´

PREGUNTA 6: Encuentra el ORF y amplifícalo con primers de 6 nt

5' ATGATGTGCGATTGCCACCCAATTTTTGGAACGACTGCGACCCTATTATGA 3'

Solución: 

Longitud: 51 nt

Primer 1: 5´ATGATG 3´

Primer 2: 5´TCATAAT 3´

PREGUNTA 7: Encuentra el ORF y amplifícalo con primers de 6 nt

5' GTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGCGGTCACGTATTTCATGCGCGATGGAAA 3'

Solución:

Longitud 42 nt

Primer 1: 5´TTATAA 3´

Primer 2: 5´ATGAAA 3´

PREGUNTA 8: Encuentra el ORF (que sea mayor de 30 nt) y amplifícalo con primers de 6 nt

5' ATGGTATGTTTTATAAAGTCGGATATCTAACCCTTGTCACGTATTTCATGCGCG 3'

Solución: 

Longitud 39 nt

Primer 1:  5´ATGAAA 3´

Primer 2: 5´TTATAA 3´

PREGUNTA 9: Encuentra el ORF y amplifícalo con primers de 6 nt

5' ACTTTATAAAGTCGGATATCTAACAAACCTTGCGGTCACGTATTTCATGCGCGATGGAAGC 3'

Solución:

Longitud 45 nt

Primer 1: 5´TTATAA 3´

Primer 2: 5´ATGAAA 3´

Para saber más:

https://eead-csic-compbio.github.io/bioinformatica_estructural/node28.html