Páginas

sábado, 13 de octubre de 2018

Extracción de ADN a partir de sangre periférica

Extracción de ADN a partir de sangre periférica método de salting out
Extracción de DNA de sangre periférica usando el método de salting out. Obtener DNA de buena calidad y cantidad a partir de sangre periférica humana. Esta práctica de laboratorio incluye la extracción de sangre periférica y la obtención de material genético para posterior análisis en el laboratorio de biología molecular.

Este protocolo se basa en una modificación comercial del protocolo de Miller y Dykes, 1988, que básicamente consta de unos lavados sucesivos con buffer de lisis de glóbulos rojos (Tris-HCl 10 mM pH 8, Tritón X 100 1 %, sacarosa 11 %). Luego, se lisan los nucleos con una solución de Tris-HCl 10 mM, NaCl 400 mM, EDTA 2 mM, Proteinasa K 0,1 mg/ ml y SDS 2 %. Las proteínas se eliminaron por precipitación salina con acetato de potasio 3 M y el DNA se precipitó con isopropanol y etanol 70 %. El DNA se conservó a -20 °C en agua destilada libre de DNasas hasta su utilización

Referencia: Miller S.A., Dykes D.D. y Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. 16(3): p.1215. 1988.

Aparatos, equipos e instrumentos Cantidad Requisitos técnicos
Vórtex 1

Juegos de micropipetas (10, 200, 1000 ul) 3 calibradas
Centrífuga 1 calibrada
Microcentrífuga 1 calibrada
Balanza analítica 1 calibrada
Baño maría 1


Calidad de DNA

El DNA aislado idealmente usando el kit de extracción de invitrogen tendrá un valor >1.80 al cuantificarla en un espectrofotómetro con una absorbancia / cuando las muestras están diluidas en el eluyente (Tris-HCl pH 7.5) lo cual indica que el DNA está razonablemente limpio de proteínas que pudiesen intervenir con aplicaciones siguientes. La ausencia de RNA contaminante se podría confirmar al realizar una electroforesis en gel de agarosa

Materiales y reactivos

Materiales
Cantidad
Especificaciones
Tubos eppendorf
20 unidades c/u
0,2-0,5-1 ml
Gradillas
3 unidades
Para tubos eppendorf
Guantes de látex
30 pares
Talla M y L
Guardianes
3 unidades

Puntas de micropipeta
1 rack c/u
0,2-0,5-1 ml
Jeringuilla/ vacuntainer
6
5 ml
Tubos EDTA
6
5 ml
Toallas de papel
30

Torundas de algodon
30

Torniquete
6

Reactivos
Cantidad
Especificaciones
Agua miliQ
100 ml

Etanol frío
100 ml
99%
Isopropanol
100 ml
99%
Reactivo Salting Out Wizard

7 Reacciones

EXTRACCIÓN CON EL KIT WIZARD GENOMIC (PROMEGA)Para ver manual clica aquí

Lisis de Glóbulos Rojos

 En un tubo eppendorf de 1,5 ml, combine 300 ul de sangre con 900 ul de Cell Lysis Solution y mezcle por inversión.
2   Incube por 10 minutos a T ambiente.
3   Centrifugue a 13,000–16,000 × g*; 20 seg
4   Descarte el sobrenadante, Vórtex breve al pellet.

Lisis de Núcleos y Precipitación de Proteínas

5   Adicione 300 ul de Nuclei Lysis Solution, Mezcle por inversión.
6   Adicione 100 ul de Protein Precipitation Solution; vórtex por 20 seg.
7   Centrifugue a 13,000–16,000 × g*; 3 minutos

Precipitación de DNA y Rehidratación del pellet

8   Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo, al que se le haya adicionado previamente 300ul de isopropanol. Mezcle suavemente para observar la madeja de ADN en formación.
9   Centrifugue a 13,000–16,000 × g*; 1 minuto
Discarte el sobrenadante, adicione 300 ul de etanol (same volume as isopropanol).
Centrifugue como en el paso 9.
10  Retire el etanol, y deje secar el pellet (10–15 minutes), a temperatura ambiente
Rehidrate el DNA en 100 ul de Agua MiliQ o buffer Tris EDTA pH7,3 por 1 hora a 65°C o de un día para otro a 4°C.

Los datos que se registrarán serán los obtenidos en la medición de calidad de DNA en el espectrofotómetro mediante el Qubit. Para obtener el manual clica aquí. Se deberá elaborar el informe sobre la práctica de acuerdo a la rúbrica detallada en el punto 6 de la presente guía. El cuestionario correspondiente a esta práctica es el siguiente:

¿Por qué el buffer de lisis celular deja intactos los núcleos de las células?


¿Qué principio opera cuando usted agrega la solución de precipitación de proteínas? ¿Qué pasaría si se agregara una solución menos concentrada? (una décima parte de la que utilizó)

¿Qué sucede cuando se agrega el Isopropanol? ¿Qué pasaría si agrega el mismo volumen de etanol? ¿Qué pasaría si agrega 2,5 volúmenes de etanol?

¿Procede el ADN que extraemos de la sangre periférica de glóbulos rojos?

Para acceder al MANUAL del Qubit PRESIONA AQUÍ
Como control positivo añadimos 10 ul de ADN de concentración conocida.

Lectura de la muestra del control positivo = 6.32

Concentración ADN control positivo = 6.32 x 200 / 10 = 126.4 microgramos /ml


Lectura de la muestra alumno en el Qubit = 0.0555

Concentración ADN = 0.0555 X 200 / 10 = 1.11 microgramos/ml

No hay comentarios:

Publicar un comentario